Wprowadzenie do zasady i zastosowanie ogólnych elementów spektrofotometru

Spektrofotometr jest szeroko stosowany w badaniach biologicznych, chemicznych, klinicznych i środowiskowych.
Spektrofotometria mierzy, ile światła substancja chemiczna może pochłonąć, przepuszczając wiązkę światła przez próbkę w spektrofotometrze.
Poprzez pomiar wykrytego natężenia światła można zastosować metodę do ustalenia stężenia substancji rozpuszczonej w próbce.
Pojęcie spektrofotometrii
Wiązka wysyłana do próbki składa się z wiązki fotonów.
Kiedy fotony spotykają się z cząsteczkami w próbce, cząsteczki mogą pochłonąć niektóre z nich, zmniejszyć liczbę fotonów w wiązce i zmniejszyć intensywność sygnału detekcji.
Transmitancja jest częścią światła przechodzącego przez próbkę. Jest on definiowany jako natężenie światła przechodzącego przez próbkę przy natężeniu padającego światła.
Absorbancja jest przeciwna do transmitancji, odpowiadającej ilości zmierzonej przez spektrofotometr.
Zgodnie z absorbancją stężenie próbki roztworu można ustalić na podstawie prawa Billa Lamberta, z którego wynika, że ​​istnieje zależność liniowa między absorbancją a stężeniem próbki. Zgodnie z prawem Lamberta piwa, absorbancja jest iloczynem współczynnika absorpcji, który jest miarą ilości światła pochłoniętego przez substancję rozpuszczoną przy danej długości fali i odległości, przez którą przechodzi światło. Próbka lub odległość podróży i stężenie substancji rozpuszczonej. Zasadniczo celem pomiaru absorbancji jest pomiar stężenia próbki.
Składniki spektrofotometru
Każdy spektrofotometr składa się ze źródła światła, kolimatora (soczewki lub urządzenia skupiającego do przesyłania silnych i prostych wiązek), monochromatora do oddzielania wiązek o różnych długościach fal oraz selektora długości do wyboru fali lub rowka o pożądanej długości fali. Długość fali światła zastosowanego w spektrofotometrze przedstawionym na tym filmie mieści się w zakresie światła ultrafioletowego i widzialnego. Spektrofotometr zawiera także uchwyt na próbkę, fotodetektor i ekran wyświetlający wyniki detektora.
Najnowszy spektrofotometr jest bezpośrednio podłączony do komputera, na którym można kontrolować parametry eksperymentalne i wyświetlać wyniki.
Zasada działania spektrofotometru
Podczas przeprowadzania spektrofotometrii ważne jest, aby zachować odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, w zależności od rodzaju używanego roztworu biologicznego lub chemicznego.
Włącz urządzenie i pozwól, aby lampa i elektronika nagrzały się przed pomiarem widma UV-Vis próbki.
Przygotuj ślepą próbkę tego samego roztworu o tym samym pH i podobnej sile jonowej, ale bez analizowanych składników; ponieważ kuweta i rozpuszczalnik mogą rozpraszać światło, konieczna jest analiza próbki.
Tradycyjny uchwyt próbki do spektrofotometru jest przeznaczony do przechowywania plastikowych i kwarcowych misek. Pipetuj oryginalny roztwór do miski.
Po wytarciu odcisków palców i rozlaniu ich na zewnątrz miski, włóż prawidłowo kuwetę do uchwytu na próbki i zamknij drzwiczki pokrywy.
Nigdy nie zapomnij zamknąć drzwi, ponieważ promieniowanie UV z otwartego spektrofotometru może uszkodzić oczy i skórę.
Zaprogramuj żądaną długość fali lub zakres długości fali, który zostanie przesłany do próbki. Zależy to od najlepszej długości fali, jaką może analizować analizowany element. Maszyna jest następnie zerowana przez pomiar ślepej próbki, która odejmuje dolną absorbancję ze względu na bufor próbki.
W zależności od rodzaju wykonywanego eksperymentu spektrofotometrycznego może być konieczne wygenerowanie krzywej standardowej przed pomiarem próbki, na podstawie której można określić stężenie związku analizowanego w próbce.
Pozwól próbce osiągnąć odpowiednią temperaturę i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków. Próbkę można następnie dodać bezpośrednio do miski w maszynie i dokonać odczytu.
Po zmierzeniu próbki pod względem absorbancji eksperyment jest odpowiednio obliczany; na przykład, aby określić stężenie lub poziom aktywności enzymu.
Zastosowanie spektrofotometru
Jednym z powszechnych zastosowań spektrofotometru jest pomiar gęstości komórek. Pomiar gęstości komórek można wykorzystać do stworzenia logarytmicznej krzywej wzrostu bakterii, na podstawie której można określić optymalny czas integracji rekombinowanego białka.
Spektrofotometr może także służyć do pomiaru szybkości reakcji chemicznej. W tym przykładzie wykonania absorbancję stosuje się do monitorowania reakcji enzymatycznej, która zanika z czasem w wyniku reakcji pośredniej 452 nm. Szybkość tego etapu enzymatycznego można obliczyć, dopasowując dane do odpowiedniego równania.
Wprowadzenie mikro spektrofotometru eliminuje potrzebę trzymania próbki. Spektrofotometry wykorzystują napięcie powierzchniowe do utrzymania próbki.
Mikrospektofotometr to najlepszy wybór do pomiaru masy i stężenia małych i drogich próbek, takich jak biomolekuły, w tym białka i kwasy nukleinowe.
Absorbancja białek przy 280 nm zależy od zawartości aromatycznych łańcuchów bocznych znalezionych w tryptofanie, tyrozynie i fenyloalaninie, a także od wiązania disiarczkowego między dwiema cysteinami.
Stężenie białka można określić na podstawie jego absorbancji przy 280 nm i jego współczynnika absorpcji, który jest oparty na składzie aminokwasów.
DNA i RNA mają maksymalną absorbancję przy 260 nm, na podstawie której można określić ich stężenia. Czystość kwasów nukleinowych można również oceniać na podstawie stosunku odczytów absorbancji do określonych długości fal.