Spektrofotometry stały się rutynowymi narzędziami w nowoczesnych laboratoriach biologii molekularnej. Często stosowany do oznaczania kwasów nukleinowych, oznaczania białek i oznaczania ilościowego stężeń bakteryjnych.
Prosta zasada spektrofotometru
Spektrofotometr wykorzystuje źródło światła, które może generować wiele długości fal i przechodzi przez szereg urządzeń spektroskopowych w celu wygenerowania źródła światła o określonej długości fali. Po przejściu źródła światła przez badaną próbkę część źródła światła zostaje pochłonięta i obliczana jest absorbancja próbki, przekształcając ją w stężenie próbki. . Absorbancja próbki jest proporcjonalna do stężenia próbki.
Kwantyfikacja kwasów nukleinowych
Kwantyfikacja kwasów nukleinowych jest najczęściej stosowaną funkcją spektrofotometru. Oligonukleotydy, jednoniciowe, dwuniciowe DNA i RNA można oznaczyć ilościowo w buforze. Pik absorpcji najwyższego piku absorpcji kwasu nukleinowego wynosi 260 nm. Skład cząsteczkowy każdego kwasu nukleinowego jest inny, więc współczynniki konwersji są różne. Aby określić ilościowo różne typy kwasów nukleinowych, należy wcześniej wybrać odpowiednie współczynniki. Na przykład, absorbancja 1 OD odpowiada 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA i 30 μg / ml Olig. Absorbancja po teście jest przekształcana przez powyższe współczynniki w celu uzyskania odpowiedniego stężenia próbki. Przed badaniem wybierz poprawną procedurę, wprowadź objętość roztworu podstawowego i rozcieńczalnika, a następnie przetestuj próbkę ślepą i roztwór próbki. Jednak eksperyment nie zawsze był płynny. Niestabilne odczyty mogą być największym bólem głowy dla eksperymentatora. Przyrządy o wyższej czułości wykazują większy dryf absorbancji.
W rzeczywistości zasada projektowania i zasada działania spektrofotometru pozwalają na zmianę absorbancji w pewnym zakresie, to znaczy przyrząd ma pewną dokładność i precyzję. Na przykład dokładność Eppendorf Biophotometer wynosi ≤1,0% (1A). Wyniki takich wielokrotnych testów różnią się od około 1,0% średniej i są normalne. Ponadto konieczne jest również uwzględnienie właściwości fizykochemicznych samego kwasu nukleinowego i pH buforu, w którym kwas nukleinowy jest rozpuszczony, stężenia jonów itp .: Gdy stężenie jonów podczas testu jest zbyt wysokie, przesunięcia odczytu, dlatego zaleca się stosowanie określonej wartości pH i niskiego stężenia jonów. Bufory, takie jak TE, znacznie stabilizują odczyty. Stężenie rozcieńczenia próbki jest również czynnikiem, którego nie można pominąć: ze względu na nieuniknioną obecność w próbce niektórych drobnych cząstek, zwłaszcza próbek kwasu nukleinowego. Obecność tych małych cząstek zakłóca wyniki testu. W celu zminimalizowania wpływu cząstek na wyniki testu, absorbancja kwasu nukleinowego musi być co najmniej większa niż 0,1 A, a absorbancja wynosi korzystnie między 0,1 a 1,5 A. W tym zakresie interferencja cząstki są stosunkowo małe, a wynik jest stabilny.
Oznacza to, że stężenie próbki nie powinno być zbyt niskie lub zbyt wysokie (poza zakresem testowym fotometru). Wreszcie, czynniki operacyjne, takie jak mieszanie, powinny być wystarczające, w przeciwnym razie wartość absorbancji jest zbyt niska, nawet wartości ujemne; mieszanina nie może istnieć pęcherzyków, pusty płyn nie ma zawieszonej materii, w przeciwnym razie czytanie dryfuje drastycznie; ta sama kuweta musi być użyta do przetestowania próby ślepej i próbki. W przeciwnym razie różnica stężenia jest zbyt duża; współczynnik konwersji i jednostka stężenia próbki są wybierane konsekwentnie; nie można używać kuwety z okienkiem; objętość próbki musi osiągnąć minimalną objętość wymaganą przez kuwetę.
Oprócz stężenia kwasu nukleinowego spektrofotometr wykazuje również kilka bardzo ważnych stosunków wskazujących czystość próbki, takich jak stosunek A 260 / A 280, stosowanych do oceny czystości próbki, ponieważ pik absorpcji białka wynosi 280 nm. Czysta próbka o stosunku większym niż 1,8 (DNA) lub 2,0 (RNA). Jeśli stosunek jest niższy niż 1,8 lub 2,0, oznacza to obecność białka lub substancji fenolowych. 230 wskazuje, że w próbce obecne są pewne zanieczyszczenia, takie jak węglowodany, peptydy, fenole itp., A stosunek czystszego kwasu nukleinowego A 260 / A 230 jest większy niż 2,0. A 320 wykrywa mętność roztworu i inne czynniki zakłócające. Dla czystych próbek A 320 wynosi zazwyczaj 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd
Dodaj: No.168 Wuchang Ave., Yuhang District, Hangzhou 310023, Chiny
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com