Spektrofotometryczne oznaczanie ilościowe białka kolorymetrycznego
Białka są zazwyczaj mieszaniną białek. Testy kolorymetryczne oparte są na składnikach białkowych: aminokwasy (np. Tyrozyna, seryna) reagują z dodatkową grupą chromogenną lub barwnikiem w celu wytworzenia zabarwionego materiału. Stężenie zabarwionego materiału jest bezpośrednio związane z liczbą aminokwasów, z którymi reaguje białko, odzwierciedlając w ten sposób stężenie białka.
Metoda kolorymetryczna
Istnieje kilka metod, takich jak BCA, Bradford i Lowry.
Metoda Lowry'ego: Oparta na najwcześniejszej reakcji Biuret i ulepszona. Białko wchodzi w reakcję z Cu2, tworząc niebieską reakcję. Jednak metoda Lowry jest bardziej czuła niż Biuret. Wadą jest potrzeba sekwencyjnego dodawania kilku różnych odczynników; reakcja zajmuje dużo czasu; jest podatny na substancje niebiałkowe; białka zawierające EDTA, Triton x-100 i siarczan amonu nie są odpowiednie dla tej metody.
Test na kwas bicinchoniinine: Jest to nowszy, bardziej czuły test na białko. Białko, które ma być analizowane, reaguje z Cu2 w roztworze alkalicznym w celu wytworzenia Cu, który tworzy chelat z BCA, tworząc purpurowy związek z pikiem absorpcji przy 562 nm. Liniowa zależność pomiędzy stężeniem tego związku i białka jest silna, a związek powstały po reakcji jest bardzo stabilny. W stosunku do metody Lowry operacja jest prosta, a czułość jest wysoka. Jednak, podobnie jak metoda Lowry'ego, jest podatna na ingerencję w białka i detergenty.
Metoda Bradforda: zasadą tej metody jest to, że białko reaguje z Coomassie Brilliant Blue, tworząc barwny związek, który absorbuje przy 595 nm. Jego największą cechą jest czułość, która jest 2 razy większa niż w Lowry i BCA. Jest to prostsze i szybsze. Wymaga tylko jednego rodzaju odczynnika reakcji. Związek może być stabilny przez 1 godzinę, aby ułatwić wynik; Zakłócając działanie Lowry, BCA reaguje ze środkami redukującymi (np. DTT, merkaptoetanol). Nadal jest jednak wrażliwy na detergenty. Główną wadą jest to, że różne standardy mogą prowadzić do dużych różnic w wynikach tej samej próbki i braku porównywalnych wyników.
Niektórzy badacze, którzy po raz pierwszy są wystawieni na pomiary kolorymetryczne, mogą być zdezorientowani wynikami różnych testów kolorymetrycznych. Jakich metod uważasz, że są zdezorientowane? Ze względu na to, że grupy reagowały w różny sposób, a grupy chromogenne nie są takie same, kilka metod jest stosowanych jednocześnie, aby stężenie próbek tej samej próbki było niespójne. Na przykład Keller i in. przetestowali białko w ludzkim mleku i odkryli, że stężenia zmierzone przez Lowry'ego i BCA były znacząco wyższe niż w Bradford. Różnica była znacząca. Nawet jeśli zostanie określona ta sama próbka, standardowa próbka wybrana za pomocą tej samej metody kolorymetrycznej jest niespójna, a stężenie po teście również nie jest spójne. Na przykład, użyj Lowry'ego do testowania białka w homogenacie komórkowym, stosując BSA jako standard, o stężeniu 1,34 mg / ml, i globulinę jako standard o stężeniu 2,64 mg / ml. Dlatego przed wybraniem metody kolorymetrycznej zaleca się odniesienie do składu chemicznego badanej próbki i znalezienie standardowego białka podobnego do chemicznego. Ponadto metoda kolorymetryczna do ilościowego oznaczania białek często powoduje problemy w tym, że wartość absorbancji próbki jest zbyt niska, co powoduje dużą różnicę między zmierzonym stężeniem próbki a rzeczywistym stężeniem. Kluczową kwestią jest to, że kolor ważnej części spektrofotometru 1011, kuwety, ma określony okres półtrwania, więc każda metoda kolorymetryczna podaje czas testu reakcji. Wszystkie próbki (w tym standardowe próbki) muszą zostać przetestowane w tym czasie. Jeśli czas jest zbyt długi, uzyskana wartość absorbancji staje się mniejsza, a wartość konwertowanego stężenia maleje. Poza tym temperatura reakcji, wartość pH roztworu itp. Są ważnymi czynnikami wpływającymi na eksperyment. Ponadto bardzo ważne jest stosowanie kolorymetrii plastycznej. Unikaj używania kuwet z kwarcu lub szkła, ponieważ kolor po reakcji spowoduje zabarwienie kwarcu lub szkła, co spowoduje niedokładną absorbancję próbki.
Firma specjalizuje się w sprzedaży spektrofotometrów , witamy klientów, którzy potrzebują konsultacji i zakupu, zapewnimy Ci szczerą obsługę i jakość produktów, a także niższe ceny.
E-mail: info@sumerlab.com
Strona internetowa: sumerinstrument.com